1941 schließt sich James Stewart der Air Force an. Damals ist er bereits ein gefeierter Schauspieler und sogar einer der bestbezahlten. Er ist seit 1935 bei Metro-Goldwyn-Mayer (MGM) unter Vertrag, was er seinem Kumpel und Mitbewohner Henry Fonda zu verdanken hat. Nach dem Studium spielt er in der Theatergruppe Falmouth Players und findet so seinen Weg an den Broadway. In Komödien spielt er aufgrund seines ruhigen Naturells meist den Schüchternen und Gutherzigen, der ungewollt in Turbulenzen hinein gerät. Erste Spuren im Westerngenre hinterlässt er mit "Der große Bluff" (1939).

1938 besetzt ihn Frank Capra für "Lebenskünstler", eine Zusammenarbeit, die bald Früchte tragen sollte. In "Mr. Smith geht nach Washington" (1939) liefert Stewart eine seiner besten Leistungen und erhält dafür seine erste Oscar-Nominierung. Die Auszeichnung sollte er bereits ein Jahr später für "Die Nacht vor der Hochzeit" kriegen, was von vielen als Entschädigung dafür gesehen wird, dass es mit der wesentlich besseren Leistung im Vorjahr nicht geklappt hat. Ein weiterer Capra-Film wird zu Jimmys Karrierehöhepunkt. "Ist das Leben nicht schön?" wird 1946 wegen seiner düsteren Handlung vom Publikum verschmäht, zählt inzwischen jedoch zu den Weihnachtsklassikern, die jedes Jahr wieder im Fernsehen gezeigt werden.

In der Nachkriegszeit ändert James Stewart seinen Lebensstil grundlegend. Er lässt sich häuslich nieder und ist für seine vier Kinder da, von denen zwei aus Glorias erster Ehe stammen, die Zwillinge werden 1951 geboren. Er engagiert sich für die Republikanische Partei und unterstützt deren Präsidentschaftskandidaten im Wahlkampf. Als sein Vertrag mit MGM ausläuft nutzt die Chance, um seine Rollen selbst auswählen zu können. Die werden zunehmend ernster und rauer und bewegen sich immer weiter von den Komödien der Anfangszeit weg. Alfred Hitchcock besetzt ihn für vier Filme.

Nachdem "Vertigo - Aus dem Reich der Toten" (1958) jedoch an den Kinokassen scheitert, macht der Starregisseur seinen Hauptdarsteller dafür verantwortlich, weil er für das Publikum zu alt sei. Fortan wolle er nie wieder mit ihm zusammen arbeiten. Die Rolle in "Der unsichtbare Dritte", die Jimmy unbedingt spielen will, geht an Cary Grant. Dafür konzentrierte sich Stewart zunehmend auf Western und spielt in zahlreichen Filmen von Anthony Mann und John Ford. Auf ausdrücklichen Wunsch von John Wayne lässt er sich 1976 überreden, einen kurzen Auftritt in "The Shootist - Der Scharfschütze" zu übernehmen.